LA CAPACIDAD DE LA DEGRADACIÓN DEL MEDIO AMBIENTE COSTERO, ADYACENTE AL RÍO ITATA, EN EL CENTRO DE CHILE.

Abstracto La respuesta del océano costero, influenciado por ambas descargas de los ríos y las entradas de producto derivado de carbono orgánico fotosintético, fue evaluada estimulando velocidades de hidrólisis microbiana de macromoléculas, con el objetivo de estimar la capacidad de degradación potencial, del ecosistema costero en Chile central. La actividad enzimática extracelular (EEA) en agua de mar estaba dominado por la actividad de aminopeptidasa en sustrato de L-leucina-4-metil-7-coumarinylamide (MCA-leu) (1,2-182 nmll1 h-1), seguido de 4-metilumbeliferil-BD glucósido (MUF-glu) (0,08 a 61 nmol-1h-1) y 4metilumbeliferil-BD-celobiosa) (MUF-cel) (0,15-7 nmol-1h-1), con los índices más altos medidos durante la primavera - verano. En aguas fluviales, la hidrólisis enzimática extracelular, se mantuvo dentro de la gama de 45 a 131 nmol-1H-1 para MCA-leu y ca. 20 nmol-1h-1 para sustratos glucosídicos, durante todo el año. Contraria a la EEA observada para la columna de agua marina, los sedimentos de la superficie extracelular enzimática de la MCA-Leu (0,04 a 6.13 nmol g-1 DWH-1) estaba en el mismo orden de magnitud que las tasas observadas de MUF-cel (0,004 a 5,1 nmol g-1 dwh-1) y MUF-glu (0,007 a 10,5 nmol g-1 dwh-1). Por otra parte, la hidrólisis en los sedimentos se caracterizó por tasas más altas durante el invierno, en comparación con la primavera-verano en las zonas costeras y estuarios. Los cinco años de datos, permitieron evaluar la potencial capacidad de procesamiento microbiana (de carbono orgánico) en la zona costera, adyacente a la descarga del río Itata, donde el aumento de la producción primaria en las temporadas productivas es acompañado por el aumento del hidrólisis de las macromoléculas. 1. Introducción

Aunque las plataformas continentales (área global 26x 1.012 m2) sostienen la producción primaria alta, y estuarios (área global de 1,05 x 1,012 m2), son reservorios de la producción primaria terrestre transportadas por los ríos, ambos constituyen una pequeña fracción del océano global (7,5%, Cai et al. 2011). Varios estudios han demostrado que las plataformas continentales secuestran más de 40% de carbono oceánico (Hedges y Keil, 1995; Muller-Karger et al, 2005). Sin embargo, hay incertidumbre en cuanto a nuestra capacidad de cuantificar el intercambio de carbono entre los sistemas marinos y terrestres (Liu et al., 2000), y las dificultades en la evaluación de los principales procesos que controlan el destino del carbono terrígeno en aguas costeras y los sedimentos (Hedges y Keil, 1995). Estas lagunas de conocimiento nos han impedido determinar porqué la mayor parte del carbono terrestre (aproximadamente 0,25 Pg), transportado al océano por los ríos del mundo cada año (Cauwet, 2002), desaparezca de los depósitos de materia orgánica, disuelta en el océano (Hedges y Parker, 1976) y sedimentos marinos (Hedges, 2002). Teniendo en cuenta la naturaleza refractaria del carbono terrestre (Hedges, 1992), Hedges y Keil

(1995) plantean el enigma del tiempo de residencia, relativamente corto de la materia orgánica terrestre, en comparación con las moléculas orgánicas marinas planctónicas, señalando el papel del océano costero en el procesamiento de la materia orgánica (Rabouille et al, 2001). En los ecosistemas de surgencia costera, la comunidad biológica se desarrolla en un entorno de alta disponibilidad de moléculas orgánicas, derivadas de las altas tasas de producción primaria, mejorando así la producción secundaria microbiana (por ejemplo: Quiñones et al, 2010). El océano costero en el sistema de la corriente de Humboldt, frente a Chile central a 36,5 ° S, se encuentra bajo la influencia del afloramiento estacional y ciclos de productividad asociadas (Daneri et al., 2000). En esta área, la surgencia costera interactúa con dos procesos físicos estacionales, que modifican la estratificación vertical: el balance de calor en la capa de mezcla durante el verano austral, y el equilibrio de agua fresca durante el invierno austral, debido a los mayores portadores de descargas de agua dulce del río Bio-bio e Itata (Sobarzo et al., 2007). La interacción de la surgencia de agua dulce y de descarga tiene un efecto notable en la química y la biología de la columna de agua. Por ejemplo, en un sitio de 30 km de la costa, observamos que el ópalo bio-génico de productividad diatomea, domina la columna de agua durante el verano, mientras que el ópalo lito-génico predomina durante el invierno austral (Sánchez et al, 2008). Se ha observado que la actividad heterotrófica microbiana se ve reforzada por la entrada de materia orgánica, por ambas producciones; de fitoplancton y las fuentes fluviales, eso explica las tasas de consumo microbianas, mejoradas en los límites entre los ríos y aguas oceánicas (Albright, 1983; Kirchman et al., 1989). Solo una pequeña fracción del depósito de materia orgánica son monómeros, capaces de ser transferidos, directamente, a los microorganismos para la re-mineralización, de ese modo, la hidrólisis y la utilización de biopolímeros autóctonas y alóctonas, como las proteínas y los hidratos de carbono eficiente, son cruciales para el mantenimiento de altas tasas de crecimiento microbiano y la degradación asociada a lo orgánico (Azam 1998). Las enzimas extracelulares de microbios acuáticos (Chróst 1991), son componentes clave en la hidrólisis de los abundantes bio polímeros. La hidrólisis extracelular es el paso inicial en la mineralización del carbono, en el que las macromoléculas orgánicas se descomponen en sustratos más pequeños, capaces de ser incorporados a través de la membrana celular de los microorganismos (por ejemplo: Rey 1986. Chróst 1991; Hoppe 1991; Pantoja et al 1997; Arnosti 2003), lo que afecta el destino de la materia orgánica en el medio marino (Arnosti 2001). En este trabajo, emprendimos el estudio de la variabilidad temporal y espacial, del hidrólisis enzimática extracelular de hidratos de carbono y proteínas, como proxy de reelaboración microbiana, en el ecosistema de surgencia costera, adyacente al río Itata en el centro de Chile. Se utilizaron moléculas fluorogénicos MUF -glu, MUF -Cel y

MCA- Leu para representar sustratos de diferente reactividad y diferentes modelos de enzimas extracelulares (glucosidasa, glucanasa, y aminopeptidasa, respectivamente). Por lo tanto, representamos la materia orgánica marina como el modelo molecular de proteína de MCA- Leu, y el pozo más refractario de la materia orgánica asociada a la entrada como el modelo molecular de la celulosa (MUF - glu y MUF – cel). Nuestro objetivo es obtener una comprensión más profunda de la capacidad de degradación de esta zona costera, en relación con la disponibilidad de carbono para el consumo de heterótrofos. Se necesita una visión precisa de la magnitud de reelaboración de materia orgánica del océano costero, para entender cómo el océano costero podría responder a las perturbaciones naturales y antropogénicas (Ver et al 1999; Rabouille et al. 2001).

2. Materiales y métodos

2.1

área de estudio.

Estudiamos la zona costera de la zona centro - sur de Chile (ca. 36,5 ° S) bajo la influencia directa del sistema de la corriente de Humboldt (Strub et al., 1998). Una de las principales características de este sistema costero es la ocurrencia de eventos de fertilización, debido al afloramiento de aguas ricas en nutrientes del subsuelo en la zona durante la primavera - verano austral (por ejemplo: Ahumada y Chuecas 1979, que promueve tasas muy altas de producción primaria (Daneri et al 2000; Montero et al 2007), y descargas importantes de peces comercializados (Quiñones et al 2010). Las aguas de surgencia también tienen bajas concentraciones de oxígeno, generando así una capa subóxica de temporada, por debajo de 20 m de profundidad (Sobarzo y col. 2007). La estructura térmica de la columna de agua durante la primavera y el verano, es controlada por la radiación solar en la parte superior en los 10 m y surgencia favorable del estrés del viento, por debajo de 15 m de profundidad, lo que resulta en una capa superficial estratificada y aguas de baja temperatura debajo de la termoclina. Durante el invierno, la estratificación halina se observa en la capa superior, debido a la precipitación, de descarga de agua dulce mejorada del bio bio y ríos Itata, más el hundimiento debajo de la termoclina inducida por los vientos del norte (Sobarzo et al., 2007). El océano costero recibe una notable cantidad de material terrígeno de los ríos adyacentes, lo demuestra el predominio de litogénico sobre ópalo biogénico durante el invierno austral (Sánchez et al., 2008) y la presencia de fenoles de lignina en los sedimentos costeros (Schubert et al., 2000). Las observaciones se llevaron a cabo en los ambientes marinos y fluviales de Chile central, latitudes que abarcan desde los 36 ° 19 ' S y 36 ° 7 ' S hasta los 73 ° 19 ' W a 72 ° 40' W y que rodea la desembocadura del río Itata tan lejos como 20 NM (37km) de la costa (Fig. 1). El muestreo cubrió áreas costeras bajo la influencia directa de la descarga

del río y bajo un régimen de temporada fuerte de afloramiento y productividad marina. El río Itata tiene una duración de aproximadamente 195 kilometros y su transporte de masa de agua en la boca es, en promedio, 240 m3 s-1 (Dussaillant 2009). Durante diciembre del 2009, se instaló la eliminación de residuos submarinos, de una importante planta de tratamiento. La tubería es de 2 km de largo, y está situado a 30 m de profundidad cerca de la estación 6 de muestreo (Fig. 1).

2.2

Toma de muestras de agua y sedimentos

Hemos llevado a cabo 26 campañas de muestreo entre 2006 y 2010, que cubre 16 campos de observaciones durante la primavera-verano austral y 10 en otoño -invierno (Tabla 1) a bordo del buque de investigación Kay - Kay II (Universidad de Concepción) y pequeñas embarcaciones de los estuarios y el río de muestreo. Se visitaron treinta ubicaciones; 3 sitios de muestreo de ríos, estuarios sitio 1, y 26 en el océano costero (Fig. 1). Nuestro conjunto de datos incluyó una muestra casi mensualmente en la estación costera de series temporales del Centro de OPAS (estación 18, http://www.copas.udec.cl/eng/research/serie). Esta estación costera se caracteriza por una marcada estacionalidad en las condiciones hidrográficas, como resultado de la surgencia intensiva durante la primavera y el verano austral, y la entrada de agua dulce durante el invierno (Sobarzo et al., 2007). La estacionalidad también se observa en la productividad y la respiración de la comunidad marina (Montero et al., 2007), la clorofila -a y la biomasa del fitoplancton (González et al., 2007). Las muestras de agua de mar y de río fueron recogidos con botellas y bombonas de polipropileno Naskin de muestras de superficie, que se utilizaron para la determinación de nutrientes, clorofila-a, proteínas, la producción primaria y la hidrólisis extracelular de proteínas e hidratos de carbono. Las muestras de agua para estos parámetros se recogieron en varios metros de profundidad entre 1 y 110 m. Las muestras de sedimentos superficiales, (0-1 y 1-2 cm), se recogieron con un nucleador de caja o una draga Van Veen, el que luego se almacenó a 4 ° C, hasta su llegada al laboratorio, para así ser procesados para los experimentos de hidrólisis de incubación.

2.3

Experimentos de columna de agua.

La temperatura, la salinidad y el oxígeno en la columna de agua, se registraron con un Sea Bird SBE 19 más CTD y los datos se procesaron con el software del océano Vista de datos 4.3.5 (Schlitzer. 2010). Las muestras de agua para NO3 se filtraron a través de 0,7 micras (Whatman GFF) y ambos filtros se congelaron a -20 ° C. El filtrado se analizó, para el nitrato, con el método espectrofotométrica de Strickland y Parsons (1972), y los filtros se dividieron para la determinación de

clorofila -a por fluorometría (Parsons et al. 1984) y las proteínas de partículas por HPLC. Las proteínas de partículas, se analizaron como ácidos totales, aminoácidos hidrolizables, por cromatografía de alta presión, acoplado a un detector de fluorescencia en línea, establecido en 330 nm (excitación) y 450 nm (emisión) en un HPLC Shimadzu. Las submuestras de filtros se colocaron en 2 ml de solución de hidrólisis purgado -N2 durante 1,5 horas a 150 ° C y se neutralizaron. Las alícuotas de la solución neutralizada, se derivatizaron antes de la inyección con oftaldialdehído y 2- mercaptoetanol según Mopper y Lindroth (1982). La separación y cuantificación de los 15 aminoácidos se realizaron en una columna C18 Kromasil, utilizando un programa de gradiente de 0.025 M de acetato de sodio y 5 % de tetrahidrofurano. Se analizaron las proteínas disueltas como, aminoácidos combinados en submuestras, de agua de mar filtrada, acidificada después de restar las concentraciones de aminoácidos libres de disueltos. El análisis por HPLC se realizó como anteriormente. Las determinaciones de los índices de producción primaria, se llevaron a cabo a los 5, 10, 20, 30, y 40 metros de profundidad en la estación 14 (Fig. 1), ésto a partir de los cambios en las concentraciones de oxígeno disuelto, observados después de incubar a la luz in situ y en botellas oscuras (Strickland, 1960). El agua de las botellas de Niskin se transfirió a otras 125 botellas de borosilicato ml (gravimétricamente calibrado). En cada profundidad de incubación, se incubaron cinco botellas claras y cinco oscuras, de forma in situ, durante 8-9 horas, unidas a una boya de amarre en la superficie y anclada en el fondo del mar, posteriormente, fueron tratados con el reactivo de Winkler. Las concentraciones de oxígeno se determinaron manualmente, de acuerdo con el método de Winkler (Strickland y Parsons, 1972). La producción de oxígeno se convierte en unidades de carbono, usando un cociente fotosintético de 1,25. Las tasas de producción primaria, discretas, fueron integradas para toda la columna de agua. Nuestros datos se combinaron con las mediciones de producción primaria adicionales publicados por Daneri et al. (2000) en el área de 35 ° 00 'S y 73 ° 00 ' W a 75 ° 00 ' de 36 observaciones 1989-1991. Las sub-muestras de un litro de agua, de las botellas de Niskin, se removieron inmediatamente y se colocaron en bombonas de ácido limpio, hasta la llegada al laboratorio (10 horas después). Las bombonas con las muestras de agua se oscurecieron y se mantuvieron a 4-7 ° C a bordo, utilizando baños de agua con bolsas de hielo o un refrigerador. Mientras que el sistema de incubación se estaba preparando de nuevo, en el laboratorio (1-2 horas), las bombonas se mantuvieron en una cámara fría a 4-7 ° C en la oscuridad. Después de la adición del sustrato, los frascos se incubaron a ca. 10 ° C bajo agitación continua. Esta temperatura es representativa de la temperatura in situ (9.9 a 12.8 ° C).

Las estimaciones de la actividad enzimática extracelular, se llevaron a cabo por duplicado basados en 5 mL alícuotas de agua de mar, que se incubaron en la oscuridad con L-leucina-4-methylcoumarinyl-7-amida (MCA-Leu), 4-metilumbeliferil-BDcelobiosa (MUF- cel) y 4-metilumbeliferil-BD-glucósido (MUF-glu) a 10 concentraciones finales uM (Hoppe, 1983). La fluorescencia se midió a tiempo cero, y cada 2 horas durante 6 horas a 365 nm de excitación y 455 nm de emisión. El agua de mar hervida se utilizó para comprobar la fluorescencia de fondo, que era insignificante en esas longitudes de onda. Las curvas de calibración, se construyeron mediante la medición de la fluorescencia de soluciones standard de MCA y MUF, preparados en agua de mar y filtrada a concentraciones que oscilan entre 0,03 y 0,5 uM. Las curvas estándar se prepararon para cada experimento. Se hizo una calibración de un punto, en el comienzo de la incubación, con 0,5 uM MCA y la curva de calibración en el final de cada experimento con productos de hidrólisis MCA y MUF a concentraciones que oscilan entre 0,03 y 0,5 uM. El mayor cambio en la fluorescencia, antes y después del experimento, para el 0,5 uM MCA fue del 2%. Las constantes de velocidad de primer orden se calculan a partir de la pendiente de la gráfica en [Co / (Co-P)] frente al tiempo, en donde Co es la concentración inicial de sustrato (MCA-Leu, MUF-glu, MUF-cel) y P es la concentración del producto (MCA, MUF) en el tiempo t (Pantoja y Lee, 1994). Las velocidades de hidrólisis reales se calculan multiplicando las constantes de velocidad de Co. Las tasas discretas se profundidad se integraron a través de la columna de agua, y las tasas de hidrólisis de carbono, calculadas usando el factor de conversión del 72 por MUF-glu y MCA-Leu, y 144 para MUF-cel (Hoppe, 1983). Durante abril del 2007, determinamos el parámetro enzima Ks y Vmax con MCAleu y MUF - cel mediante la incubación de muestras de aguas superficiales, utilizando 0,75, 5, 20, 50, 100, 250, y 500 M de sustratos. Todas las muestras experimentales se trataron como se ha descrito anteriormente. 2.4

Mediciones de sedimentos superficiales

Las muestras de sedimentos fueron mantenidas en contenedores con bolsas de hielo o en un refrigerador a 4 ° C hasta su llegada al laboratorio (dentro de 10 horas). Las estimaciones de la actividad enzimática extracelular, en los sedimentos, se llevaron a cabo en el sedimento no perturbado, mini- núcleos duplicados que contenían ~ 10 ml de sedimento húmedo. Los sedimentos fueron inoculados con MCA- Leu, MUF - cel, y MUF - Glu en ~ 50 M de concentraciones finales (Meyer - Riel, 1986), y se incubaron en la oscuridad a ca. 10° C. En los cursos de tiempo 0 y 9 horas, el sedimento se centrifugó a 3500 rpm durante 5 min, y el sobrenadante se filtró por 0,2 M en filtros Durapore. Las curvas de calibración se determinaron con agua de los poros, como se describe anteriormente. Los sedimentos hervidos se utilizaron para comprobar la

fluorescencia del fondo, que era insignificante en esas longitudes de onda. Los gramos de sedimento seco se transformaron en volumen de sedimento como en Berner (1980). Las tasas de producción primaria, las tasas de hidrólisis de la columna de agua y las velocidades de hidrólisis en sedimentos superficiales, se promediaron para el invierno (junio a agosto), y el período de primavera-verano (septiembre a marzo). 3 RESULTADOS 3.1 Características físico-químicos y biológicas de la zona costera, adyacente a la desembocadura del río Itata. La variabilidad estacional se observó en la distribución vertical de la temperatura. Así, durante las aguas frías de invierno (< 11- 12 ° C) se distribuyeron homogéneamente en la columna de agua (Fig. 2a). Por el contrario, durante la primavera y el verano las temperaturas se observaron más alta que 13 ° C y con una columna de agua estratificada. La distribución horizontal de la temperatura mostró cambios hacia el mar, con la termoclina se observó a ~ 30 m en las estaciones de alta mar durante el período de primavera - verano. Contrario a esto, en invierno la temperatura permaneció distribuida homogéneamente a lo largo de la gradiente. La variabilidad estacional de la salinidad también se observó en las aguas superficiales, con baja salinidad (28,5-33), registrados durante el invierno a una profundidad de ~5m en la parte superior, lo que indica la influencia del agua dulce en la descarga de los ríos Itata, llegando a más de 7 km de la costa. Durante la primavera y el verano, la salinidad fue más homogéneamente distribuida y la influencia del agua dulce se restringió a las aguas superficiales en los principales ~3 km de la costa. Las condiciones, permanentemente, subóxicas (< 22 M 02) se evidenciaron por debajo de ~ 60 m de profundidad durante todo el periodo de muestreo. Aunque no hay grandes cambios temporales se observaron en las concentraciones de oxígeno, durante la primavera-verano del oxiclina, el cual se elevó, aproximadamente, 20 m de las estaciones costeras. Ese patrón fue similar a la observada para la temperatura (con aguas frías que llegan a unos 20 m) indicativos de las aguas de surgencia. Las concentraciones de nitrato oscilaron entre 5 y 20 mM en la parte superior ~ 30 m durante el invierno. Por debajo de esta profundidad, la concentración de nitrato fue en el orden de 25 mM. El nitrato varió entre 10 y 20 mM en la parte superior de 20 m durante la primavera-verano. Se observó que las concentraciones más altas (~ 40 m) de nitrato durante la primavera y verano austral en las aguas profundas, alcanzaron ca. 20 m de profundidad, hacia las estaciones costeras, lo que sugiere el efecto de afloramiento estacional como se ha descrito antes. La suspensión de partículas en la columna de agua, mostraron diferencias en las aguas superficiales dependiendo de la temporada, > 2 M durante la primavera-verano

en la parte superior de 20 m, y aproximadamente 1 M durante el invierno. Por debajo de 30 m de profundidad, las concentraciones disminuyeron a ca. 0,5 M en invierno y primavera-verano. Las concentraciones de proteínas disueltas (como aminoácidos combinados disueltos) fueron, generalmente, mayor en invierno que en primavera verano y, generalmente, aumenta con la profundidad en invierno. Las concentraciones de primavera-verano disminuyeron con la profundidad de un máximo de 3,1 micras, con 10 m de profundidad a un mínimo de 1,2 M por debajo de 40 m.

3.2 Hidrólisis enzimática extracelular en la columna de agua, desde el río a 20 km de la costa. La hidrólisis enzimática extracelular, en la superficie del agua de mar, estaba dominado por la actividad aminopeptidasa (MCA- leu), que varió desde 1,2 hasta 182 nmol 1-1h - 1 y era al menos un orden de magnitud mayor que la actividad observada para sustratos MUF -glu (0,08 61 nmol 1-1h - 1) y MUF - cel (0,15-7 nmol 1-1 h- 1). No se observaron diferencias estacionales en la actividad enzimática extracelular con las velocidades de hidrólisis más altos de MCA- leu (181,9 nmol l -LH- l), MUF -glu (61 nmol l -LH- l), y MUF - cel (7 nmol ll hl) durante la primavera-verano en la zona costera entre 0 y 20 km de la costa. Durante el invierno, la hidrólisis extracelular, en la zona costera, se redujo a valores que variaron entre 1,2 y el 56,7 nmol l - l h - l para MCA- leu y desde 0,08 a 6.9 nmol l - l h - l para sustratos glucosídicos MUF - cel y MUF - glu. A lo largo de las estaciones de río, la hidrólisis enzimática extracelular se mantuvo dentro de la gama de 40 a 131 nmol l - l h - l para MCA- leu y aproximadamente 20 nmol l- l -l h para sustratos glucosídicos durante el invierno. Durante el verano, la hidrólisis de MCA- leu promedió 101 ± 20 nmol l - l h - l en el río, 83,3 ± 20 nmol l - l h - l en el estuario y 93,5 ± 50,2 nmol l - l h - l en aguas costeras. Durante la primavera - verano la hidrólisis extracelular de MCA- leu, en aguas fluviales, promedió 96 ± 20 nmol l- l h- l (n = 7) y fue similar a los observados en las aguas costeras 93.5 ± 50.2 nmol l- l h- l) (n = 34). No se observaron cambios importantes en las tasas de hidrólisis entre ríos y aguas costeras. La relación de la potencial actividad de la proteína, frente a los hidratos de carbono [(KMCA - leu) / (KMUF - cel + kMUF -glu)], mostró un aumento general hacia los sitios marinos, los cuales eran más pronunciados durante el invierno.

3.3 Hidrólisis enzimática extracelular en los sedimentos superficiales, a lo largo de una gradiente - costa afuera. La estacionalidad del hidrólisis se caracteriza por tasas más altas durante el invierno que en primavera-verano, ésto en las zonas costeras y de estuarios. La

hidrólisis extracelular de MCA- leu varió de 0,04 a 6.13 nmol g dw - l - l h durante el invierno, y de 0,24 a 2,78 nmol g - l - l dwh durante la primavera y el verano. Para sustratos glucosídicos, la hidrólisis extracelular durante el invierno osciló entre 0,007 y 13,1 nmol g dw - l h -l y durante la primavera y el verano desde 0,27 a 9.33 nmol g dw l - l h, en la zona adyacente a la descarga del río Itata. No se observaron grandes cambios estacionales, en la hidrólisis enzimática extracelular, de los sedimentos fluviales. Las tasas estimadas estaban en el rango bajo de los observados, para los sedimentos costeros. La hidrólisis de MCA.leu varió desde 0,07 hasta 2,3 nmol g dw - l - l h durante el invierno y 0,11-0,38 nmol g dw - l - l h durante la primavera - verano. Para los sustratos glucosídicos, las tasas de hidrólisis, oscilaron entre 0.30-0.86 y 0,069 a 1,7 nmol g dw - l - l h durante la primavera - verano y el invierno. La proporción de proteína a los carbohidratos de hidrólisis [(KMCA - leu) / (KMUF – cel + kMUF-glu)] se mantuvieron, aproximadamente, constante durante todo el año y en todos los ríos y sedimentos superficiales. En casi el 50 % de los casos, la hidrólisis de carbohidratos fueron más altas que las de MCA- Leu. La comparación de las tasas de hidrólisis de MCA- leu, a lo largo del tiempo, en un sitio cerca del tubo de desagüe submarino, no mostró ninguna diferencia en la degradación -atribuible al efecto de la descarga- del tratamiento secundario de la industria de la planta, en la columna de agua. En los sedimentos superficiales, se observó un aumento de la actividad enzimática extracelular en las pocas mediciones, llevadas a cabo después de que el flujo de salida se introdujera en esta zona costera. Teniendo en cuenta que el tubo de desagüe (30 m de profundidad) se mantiene por debajo de la termoclina, cuando se estratifica la columna de agua (primavera y verano), no podemos descartar cualquier posible efecto de la salida de sedimentos superficiales.

DISCUSIÓN 4.1 Características físico-químicos y biológicas de la zona costera, adyacente a la desembocadura del río Itata. Los cambios temporales en las condiciones hidrográficas, fueron observadas en la zona costera adyacente al río Itata - reflejando la variabilidad estacional - descrita por el Sistema de la Corriente de Humboldt en la zona centro - sur de Chile (Strub et al 1998; Daneri et al 2000; Figueroa y Moffat, 2000; Sobarzo et al; 2007). Durante la primaveraverano, se indicó un aumento de la temperatura de la superficie, y una termoclina poco profunda, en una columna de agua estratificada. Durante este período, fría, rica en nutrientes y aguas pobres en oxígeno llega a ca. 20 m de profundidad en la zona costera, que apunta a la influencia de las condiciones de surgencia en la estructura vertical de la columna de agua. Durante el invierno, se observó una capa de baja salinidad a lo largo del, gradiente de alta mar de la costa en las aguas superficiales (~0-

5m), lo que indica la influencia de la entrada de agua dulce desde el río Itata. Estos cambios estacionales en la variabilidad hidrográfica son consistentes con estudios previos en este ecosistema costero (Sobarzo et al. 2007) que identificaron dos eventos de surgencia y afluencia de agua dulce a partir de las descargas de los ríos, como los principales procesos que determinan la estructura vertical de la columna de agua. Como consecuencia de la surgencia, se observa alta producción primaria en el ecosistema costero de la zona centro - sur de Chile, durante la primavera y el verano (Daneri et al 2000; Montero et al., 2007). Nuestros resultados para el área adyacente de la desembocadura del río Itata, mostraron diferencias en las tasas de productividad, entre el invierno austral (~0 molCm - 2d -1) y primavera-verano (0,1 molCm - 2d- 1). Estos valores estaban en el rango de las mediciones anteriores en la zona (Daneri et al. (2000)). Además, los valores más altos de producción primaria, durante el verano, fueron acompañados por altas concentraciones de proteínas clorofila-a y de partículas. Durante el invierno, la producción fotosintética en el ecosistema costero de Chile disminuye (Daneri et al 2000; Montero et al 2007), tal como se refleja por la clorofila -a y proteínas observadas en el área de estudio.

4.2 Hidrólisis enzimática extracelular en agua de mar y sedimentos superficiales. El experimento de saturación resultó en un Ks (constante de Michaelis -Menten) y Vmax de 12 mol l- l y 0,13 mol l- l h- l, respectivamente, para MCA- leu y de 38 micras y 1 mol l- l h- l para MUF - cel. Para la comparación de Ks la concentración de las proteínas disueltas, en las aguas superficiales, promedia de 3,8 ± 2,6 M en invierno y 2,5 ± 2,7 M en primavera - verano de la zona de estudio, y las concentraciones de polisacáridos varían de 1 a 82 M por varios océanos (Pakulski y Benner, 1994; Myklestad y Borshein 2007).

Se observaron varios patrones, en las velocidades de hidrólisis en este estudio. En primer lugar, las tasas de hidrólisis de sustratos de proteína, fueron de 4 a 7 veces más altos que los de los hidratos de carbono en el agua de mar. Este patrón se ha observado anteriormente (por ejemplo: Arnosti, 2011) y se ha atribuido a la mineralización preferencial del nitrógeno orgánico, con respecto al carbono en el medio marino (Lee et al., 2004), y puede ser apoyado por más taxones bacterianos con genes que codifican los transportadores de aminoácidos en lugar de azúcares (Poretsky et al., 2009). En los estuarios y las aguas fluviales y sedimentos, se observó que las tasas de hidrólisis de proteínas fueron 5-10 veces más rápido que la hidrólisis de los hidratos de carbono. Dentro de la columna de agua, las velocidades de hidrólisis de los sustratos, fueron siempre mayores en las aguas superficiales (datos no mostrados), tal como se indica

anteriormente para este ecosistema (Gutiérrez et al. 2011) y otras áreas costeras tales como el Golfo de Génova, frente a la costa de Liguria en el Mar Mediterráneo (Misic y Fabiano, 2006), así como en el sistema de surgencia del norte de Chile (Pantoja et al., 2009). Este patrón se atribuye a la mejora de la producción primaria y asociada exudación de compuestos orgánicos, en la zona fótica (Gutiérrez et al. 2011); una tendencia que también se ha observado con la actividad aminopeptidasa lo largo de una gradiente eutrofización en lagos (Chróst y Siuda de 2006). Observamos diferencias estacionales en la actividad potencial del sustrato glucosídico y proteínas en el río, estuarios y aguas costeras. La hidrólisis de los tres sustratos, fue mayor durante el invierno en el río y el estuario, en comparación con los espacios marinos, mientras que en primavera-verano, este patrón no era evidente y la hidrólisis de la MCA- leu y MUFglu era, aproximadamente, constante en todos los entornos, mostrando una disminución de la actividad de MUF - cel hacia los espacios marinos. Para la comparación; en un corte transversal del río Sacramento, hacia la bahía central, en el norte de la Bahía de San Francisco, Murrel et al (1999) se observó, en general, una mayor actividad de aminopeptidasa en las aguas marinas, y la actividad de β – glucosidasa - fue mayor en las aguas de los ríos. Las tasas de hidrólisis, estimadas para los sitios ubicados a lo largo de la costa de Concepción (este estudio), fueron comparables a los medidos en el norte de la Bahía de San Francisco. Sin embargo, nuestras velocidades de hidrólisis, de la proteína para el río Itata, eran mucho que los medidos por Karrasch et al. (2006) en el cercano río Bio-Bio, y dentro del rango de los estimados para las aguas superficiales de los ríos Ottawa, Maumee y Hudson en América del Norte (Sinsabaugh et al., 1997). Se observó un aumento en las tasas de hidrólisis de MCA- leu, MUF -glu, y MUF cel en aguas costeras durante la primavera – verano, en comparación con el invierno probablemente asociado con la potenciación de la actividad biológica en las aguas marinas, reflejado en un aumento en la entrada de materia orgánica fotosintética, apoyada por la relación entre la AEMA inducida por MCA - leu, MUF - glu, y MUF cel y la clorofila -a (p = 0,00001, 0,00004 y 0,03, respectivamente). Otros estudios informan tendencias similares en la hidrólisis, a lo largo de gradientes tróficos, tales como para la actividad amino peptidasa en el Mar Caribe (Rath et al., 1993) y el mar Adriático Norte (Karner et al., 1992). Sin embargo, el suministro de materia orgánica no puede ser el único elemento de control de la actividad enzimática extracelular, ya que también se ha observado la falta de una tendencia entre la actividad glucosidasa y suministro de materia orgánica en el mar Adriático Norte (Karner et al., 1992). La hidrólisis en los sedimentos superficiales, siguió diferentes patrones que las de la columna de agua, y estaba dentro del mismo orden de magnitud, que las mediciones anteriores en sedimentos superficiales en otras zonas costeras (por ejemplo: MeyerReil, 1986, 1987; Mayer, 1989). Las velocidades de hidrólisis de MCA.leu, MUF - glu y

MUF - cel fueron mayores en los sedimentos costeros y de estuario que en los sedimentos del río durante todo el período de estudio. Aquí, la hidrólisis de MCA- leu no dominó, e incluso algunas de las tasas más rápidas fueron las de MUF - glu. Esta diferencia, entre la actividad de las enzimas microbianas en la columna de agua y sedimento, no es inesperada ya que ambos entornos podrían tener diferentes comunidades con diferentes capacidades enzimáticas (Arnosti, 2008). El patrón temporal en la hidrólisis enzimática extracelular, en los sedimentos superficiales, también fue diferente a la observada en el agua de mar, y no se observaron mayores tasas de hidrólisis durante el invierno, en comparación con la temporada primavera-verano, en los sedimentos costeros. Esto sugiere que el transporte fluvial de la materia orgánica terrestre puede mejorar la hidrólisis durante el invierno. (Sánchez et al. 2008

4.3 Los flujos de carbono en la zona costera adyacente al río Itata. Utilizando flujos medidos en este estudio e informes previos para la productividad primaria (en el área de estudio) produjimos un presupuesto de carbono simple, para la zona costera - adyacente a la descarga de los ríos Itata, y así, determinar si nuestros flujos medidos, coinciden con los de la producción de carbón orgánico o no. Adicionalmente, estábamos también interesados en la estimación de la capacidad potencial de procesar carbono orgánico, cuando la entrada de sustancias orgánicas alóctonas puede aumentar como consecuencia del incremento en el uso de la zona costera. Las tasas de hidrólisis enzimática extracelular (ΣMCA - leu + MUF - glu - cel + MUF) se estimaron a partir del promedio de las mediciones individuales recogidos durante el invierno y primavera-verano, para generar perfiles promedio de hidrólisis en la zona costera. Las tasas de hidrólisis en los sedimentos fueron, al menos tres veces inferiores a los de la columna de agua por importe de 0,02 ± 0,01 y 0,02 ± 0,02 mol Cm - 2d- 1 en invierno y primavera-verano respectivamente. En la columna de agua, las tarifas integradas fueron más altas, 0,06 ± 0,01 y 0,3 ± 0,03 moles Cm - 2d- 1 en invierno y primavera-verano, respectivamente. La diferencia en la hidrólisis entre la primavera - verano y el invierno, representa el exceso de hidrólisis entre los dos períodos que, asumimos, es independiente de la concentración de sustrato, utilizado para la incubación. Suponiendo que la hidrólisis enzimática extracelular responde, principalmente, a la disponibilidad de la materia orgánica, entonces, "Δ hidrólisis" debe reflejar el aumento de la producción primaria entre la primavera - verano y de invierno ("producción primaria Δ"). Por lo tanto, la Δ hidrólisis para la columna de agua era 0,3 ± 0,03 mol Cm - 2d- 1 y nulo para sedimentos superficiales. La producción primaria en el área de estudio varió de 0 a 0,08 mol C m 2 d - 1 durante el invierno y 0,08 a la 0,48

mol C m -2 d - 1 durante la primavera-verano, lo que resulta en una producción primaria Δ de 0,3 ± 0,2 mol C m -2 d - 1. Nuestros resultados mostraron un aumento proporcional de aproximadamente 0,25 mol C m - 2 d - 1 en la hidrólisis y la producción primaria de invierno austral a la primavera - verano. La magnitud del aumento de ambos flujos estaba en el mismo orden de magnitud que sugiere un acoplamiento entre la síntesis de la materia orgánica marina y el procesamiento de polímeros orgánicos. En conclusión, nuestro estudio pone de relieve las diferencias en la actividad hidrolítica en respuesta a la columna de agua y, la variabilidad del sedimento superficial, y la importancia potencial de la proteína y la hidrólisis de hidratos de carbono en las aguas de ríos, comparables a las del medio costero marino.